2019-11-23

常用缓冲液配置

磷酸缓冲液

（1）25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※

pH

1mol/L K2HPO4(ml)

1mol/L KH2PO4(ml)

5.8

8.5

91.5

6.0

13.2

86.8

6.2

19.2

80.8

6.4

27.8

72.2

6.6

38.1

61.9

6.8

49.7

50.3

7.0

61.5

38.5

7.2

71.7

28.3

7.4

80.2

19.8

7.6

86.6

13.4

7.8

90.8

9.2

8.0

94.0

6.2

（2）25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※

pH

1mol/L Na2HPO4(ml)

1mol/L NaH2PO4(ml)

5.8

7.9

92.1

6.0

12.0

88.0

6.2

17.8

82.2

6.4

25.5

74.5

6.6

35.2

64.8

6.8

46.3

53.7

7.0

57.7

42.3

7.2

68.4

31.6

7.4

77.4

22.6

7.6

84.5

15.5

7.8

89.6

10.4

8.0

93.2

6.8

※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值：

pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])

在此，pK’=6.86(25℃)。

 

电泳缓冲液

缓冲液

使用液

浓贮存液（每升）

Tris-乙酸（TAE）

　

　

1×：0.04mol/L Tris-乙酸

50×：242g Tris碱

0.001mol/L EDTA

57.1ml冰乙酸

　

100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

Tris-磷酸（TPE）

　

　

1×:0.09mol/L Tris-磷酸

10×:10g Tris碱

0.002mol/L EDTA

15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）

　

40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

Tris-硼酸（TBE）a

　

　

0.5×0.045mol/L Tris-硼酸

5×：54g Tris碱

0.001mol/L EDTA

27.5硼酸

　

20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

碱性缓冲液b

　

1×:50mmol/L NaOH

1×:5ml 10mol/L NaOH

1mmol/L EDTA

2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)

Tris-甘氨酸c

　

　

1×:25mmol/L Tris

5×:15.1g Tris

250mmol/L 甘氨酸

94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3）

0.1% SDS

50ml 10% SDS(电泳级)

说明：

①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。

以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。

进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

②碱性电泳缓冲液应现用现配。

③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2×SDS凝胶加样缓冲液：

100mmol/L Tris·HCl(6.8)

200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）

4%SDS（电泳级）

0.2%溴酚蓝

20%甘油

不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

凝胶加样缓冲液

98%去离子甲酰胺

10mol/L EDTA(pH8.0)

0.025%二甲苯青FF

0.025%溴酚蓝

甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。

缓冲液类型

6×缓冲液

贮存温度


Ⅰ

0.25%溴酚蓝


4℃

0.25%二甲苯青FF

40%（W/V）蔗糖水溶液


Ⅱ

0.25溴酚蓝


室温

0.25%二甲苯青FF

15%聚蔗糖(Ficoll400)


Ⅲ

0.25%溴酚蓝


4℃

0.25%二甲苯青FF

30%甘油水溶液


Ⅳ

0.25%溴酚蓝


4℃

40%(W/V)蔗糖水溶液

　

碱性加样缓冲液:

　

300mmol/L NaOH

6mmol/L EDTA


Ⅴ

18%聚蔗糖(Ficoll400)


4℃

0.15%溴甲酚绿

0.25%二甲苯青FF

使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

各种pH值的Tris缓冲液的配制

各种pH值的Tris缓冲液的配制　

所需pH值（25℃）

0.1mol/L HCl的体积

7．1

45．7

7．2

44．7

7．3

43．4

7．4

42．0

7．5

40．3

7．6

38．5

7．7

36．6

7．8

33%．5

7．9

32．0

8．0

29．2

8.1

26.2

8.2

22.9

8.3

19.9

8.4

17.2

8.5

14.7

8.6

12.4

8.7

10.3

8.8

8.5

8.9

7.0

某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml

（2）温度对50mmol/L Tris·HCl液pH值的影响

4℃

25℃

37℃

8．1

7．5

7．2

8．2

7．6

7．3

8．3

7．7

7．4

8．4

7．8

7．5

8．5

7．9

7．6

8．6

8．0

7．7

8．7

8．1

7．8

8．8

8．2

7．9

8．9

8．3

8．0

9．0

8．4

8．1

9．1

8．5

8．2

9．2

8．6

8．3

9．3

8．7

8．4

9．4

8．8

8．5

（6）常用缓冲液的pKa值

缓冲液

分子量

pKa值

缓冲范围

Trisa

12.1

8.08

7.1～7.9

HEPESb

283.3

7.47

7.2～8.2

MPOSc

209.3

7.15

6.6～7.8

PIPESd

304.3

6.76

6.2～7.3

MESe

195.2

6.09

5.4～6.8

a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。

7．温度对常用缓冲液pH的影响

缓冲体系

pKa(20℃)

△pKa/10℃

Mes

6.15

-0.110

Ada

6.60

-0.110

PiPes

6.80

-0.085

Aces

6.90

-0.200

Bes

7.15

-0.160

Mops

7.20

-0.013

Tes

7.50

-0.200

Hepes

7.55

-0.014

Tricine

8.15

-0.210

Tris

8.30

-0.310

Bicine

8.35

-0.180

Glycylglycine

8.40

-0.280
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