ELISA常见问题分析与对策

异常

结果描述

原因分析

对策

白板

显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。

试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用

检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

错加、漏加试剂底物、显色剂 A或B

严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。

洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力

确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。

终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制

每次配制时都应看清标签标明物质。

蒸馏水有问题

确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较。

显色弱、灵敏度低

实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。

试剂盒超过期， 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号； 试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响；

实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。 不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。

试剂、样品用前未平衡至室温

从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡 20分钟左右。

加入试剂的体积和时间有误， 移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁；

确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。 校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。

洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力；

确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。

孵育时间及孵育温度未达到要求 ，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。

孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。 保温期内不宜多开门，以免影响保温。

洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长；

严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。

显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入；

显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂 A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入。

底物作用时间不够；

准确定时。

蒸馏水水质有问题；

测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。

实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱

待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的

如有怀疑，可复检

标本加入叠氮钠作为防腐剂

酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用 proclin、硫柳汞等其他防腐剂

阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。

未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但 质控或弱阳性标本受 温度变化影响较大而被未检出。

确认孵育的温度及孵育时间达到要求。

质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出

质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于 2-8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装，并置于-20℃以下保存。

仪器设定不正确，滤光片不匹配。

重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。

终止后，目测结果正常，但酶标仪读值结果偏低

酶标仪参数设定不正确。

重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。

灵敏度过高、板底高、高背景

终止后，整板结果显现均一的黄色或淡黄色；或阴阳性对照、质控正常，标本阴性标本 OD值过高。

整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成，如同时操作两对半试剂时，测 HbsAb板用于测HBsAg等；

实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象；

避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的干净。

显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝

显色剂 A、B未使用前避光保存

孵育温度过高或孵育时间过长；

孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。

未按要求洗板。特别是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象

严格按说明书要求洗板。

花板，一般是由于临床标本的收集、处理和保存方法不当造成

放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。

出现随机性的花板、跳孔现象

样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；

充分离心， 3000rpm6分钟以上。

加样时交叉污染；

加标本时尽量 避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。

手工洗板造成的交叉污染

手工洗板时前 3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染

洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大，造成 花板、跳孔

疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。

拍板时交叉污染

洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。

假阳性

假阳性现象是一个综合现象，可参考上文 “灵敏度过高、板底高、高背景” 中的分析。这里只列举常见的原因及对策。

计算 Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的CutOff值过低，从而导致出现假阳性

CutOff值计算公式应严格参照所属产品的说明书，应注意各个酶免产品的Cutoff值计算公式不尽相同。

洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够， 洗涤不充分，样品中有其他成分残留 导致花板、跳孔，假阳性增多

严格按说明书要求洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实际情况调整至每孔注满。

血清标本处理不当，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可出现孔底由变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性；

放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。

厂家试剂质量的变化造成；

国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂灵敏度也相应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的。

水质问题；

防止蒸馏水污染。

加酶量过多（如 50uL误认为100uL）或丙肝酶稀释时加量过多；

加酶前检查移液器调节量是否准确，稀释酶时思想要集中。

培养箱温度超过 37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过；

放入板以前要检查培养箱的温度，准确定时。

底物配制时间过长、或底物污染；

底物应在酶反应完毕即将洗涤前 5分钟配制，注意避光。

该批样品放置时间过长，样品污染；

样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染。

移液嘴重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物；

移液嘴尽可能一次性使用。

重复性差

1、样品数量不一，加样时间长短不一；

重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近。

2、样品加入后未混匀；

加样后在混匀器上充分混匀。

3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对；

TMB显色用450/630波长.

4、酶标仪测定重复性差；

校对酶标仪。

5、洗涤不正确；

洗涤液注满各孔但不要溢出。洗板时反应板面向下，垂直用力甩净内容物（可多甩几次），在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔，洗涤应充分。

6、温育条件不一致（一次用水育，一次用恒温箱）

恒温箱温育较水浴显色深， OD值高出0.1-0.15,最好均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37℃。

7、不慎多加或少加酶或显色剂；

多加时显色深，少加则浅，用记号笔圈上，便于分析。

8、阈值附近时阴时阳；

同一样品做三个复孔，以二个（含二个以上相同结果为准）

9、加样量不足、保温时间、洗涤条件一致；

尽可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致。